解密诞生10周年CRISPR基因编辑技术的过去、现在和未来

今年是CRISPR基因编辑技术诞生的第10年，无疑，其已经成为生物科学领域的游戏规则改变者。然而，人们发现，这种技术的应用场景或许比想象得要更广阔。那么， CRISPR技术给当今世界带来了怎样的影响？当前都有哪些基于CRISPR的新工具呢？下一个发展方向是怎么样的呢？

CRISPR技术

CRISPR技术激起了人们的野心。只需要思考一下CRISPR的几个应用，你便能感受到这一点：基因驱动技术（该技术的原理为制造突变并使其在群体中传播开，现已展现出预防疟疾的潜力）；体内外基因疗法（已进入临床试验）；诊断检测（已有两种检测方法被紧急授权用于应对目前正在流行的新冠疫情）。

以上这些CRISPR应用都可以追溯到Emmanuelle Charpentier博士和Jennifer Doudna博士领导的一项研究。这项研究的结果发表于2012年《科学》杂志上，其描述了如何把在原核生物中发现的天然CRISPR系统（一种由RNA引导而发挥作用的DNA内切酶）作为基因编辑工具进行再利用。

阅读过这篇文章的读者可能已经注意到它的结论——CRISPR“可以为基因打靶和基因组编辑应用提供相当大的助力”低估了CRISPR的作用。实际上，你可以想象CRISPR的应用能有多么深远，或者这些应用会以多快的速度走出实验室，从而走向更广阔的世界。

CRISPR的应用已经“承诺”了如此多的好处，我们迫不及待地想看到它们被一一实现。确实，我们可能会抱怨CRISPR疗法的发展速度太慢。尽管如此，少数CRISPR疗法已进入临床试验的早期阶段，如用于治疗镰状细胞性贫血、HIV疾病和急性髓系白血病。

去年，一种基因编辑的同种异体CAR-T疗法获得了FDA再生医学先进疗法（RMAT）的认定，用于治疗复发性/难治性CD19阳性的B细胞恶性肿瘤。

我们不仅仅渴望看到CRISPR在医学上取得成功，同时也渴望将这份潜力应用到在人类面临严重挑战的其他领域中，包括农作物生产、生物能源、制造业和环境修复。

影响远超医学

但是CRISPR技术的影响远远超出了医学范畴。进化生物学家们正在利用这一技术研究尼安德特人的大脑，并调查我们的类人猿祖先是如何失去尾巴的。植物生物学家已经编辑了种子，以培育含有新的维生素或抵御疾病能力的作物。其中的一些作物可能会在未来几年内被摆上超市货架。

CRISPR技术已经如此迅速地产生影响，以至于杜德纳和她的合作者、柏林马克斯·普朗克病原学研究所的埃马纽埃尔·沙尔庞捷获得了2020年诺贝尔化学奖。诺贝尔奖委员会称赞她们在2012年的研究是一个划时代的实验。

杜德纳很早就意识到CRISPR技术会造成若干棘手的伦理问题，经过了10年的发展后，这些问题比以往任何时候都更加紧迫。

即将到来的CRISPR改变作物的浪潮将会养活全世界并帮助贫困的农民，抑或只是让投资这项技术的农业综合企业巨头变得更加富有？基于CRISPR技术的医学将会改善全世界弱势人群的健康，抑或会带来百万美元的价格标签？

关于CRISPR技术最深刻的伦理问题是，子孙后代会如何利用这项技术来改变人类胚胎。随着CRISPR技术的不断完善，对人类胚胎进行编辑可能最终成为治疗各种疾病的安全、有效的方法。

到那时，在实验室对胚胎中的致病基因进行修复是否会变得可以接受，甚至习以为常？如果父母们希望为胚胎嵌入他们更看重的特征——例如与身高、眼睛颜色或智力水平有关的特征，又会怎样？

加拿大达尔豪西大学的生物伦理学家弗朗索瓦丝·贝利斯担心，公众仍未准备好面对此类问题。她说：“我对于人们在多大程度上理解问题的要害持怀疑态度。让人们变得更好与制造更好的人是有区别的。”

为了加速CRISPR在这些领域的进展，科学家们正在不断地为CRISPR工具箱添砖加瓦。下面，我们将围绕CRISPR技术介绍一些有趣的新工具。

四大工具

工具1：可编程基因插入

针对大规模、多样化DNA cargo且不依赖于DNA修复的可编程和多重基因组技术是目前基因组编辑领域尚未解决的挑战。当前的基因整合方法仍需要能够刺激DNA发生损伤反应的双链断裂。此外，基于CRISPR的绕过双链断裂的方法如先导编辑（prime editing），则仅限于修改或插入短序列。

2021年底，两名来自麻省理工学院张锋博士实验室的博士Jonathan S. Gootenberg和Omar O. Abudayyeh展示了他们最新的CRISPR系统PASTE。

该技术通过插入一个与逆转录酶和丝氨酸整合酶融合的CRISPR-Cas9 切口酶，实现了在不同位点上的高效和多功能基因整合过程。在不产生双链断裂的情况下，PASTE可以在人类细胞系、原代细胞和静息的非分裂原代细胞中的多个基因组位点上以10%-50%的比率整合插入最大约达36 kb的序列。

”PASTE技术实现了可编程基因插入，并能够将大的cargo放入基因组的任何位置，”Gootenberg说，“这其实是治疗学、细胞工程和基础生物学的最终目标，因为我们可以以任何方式编辑基因组。也就是说，我有非常大的cargo，而我可以把它放在基因组中任何我想要放的地方。”

可编程基因插入最具前景的应用之一是在治疗方面。“有些公司正在使用先进的CRISPR方法进行单核苷酸或小片段的编辑。”Gootenberg说。这些方法很吸引人，但他补充道，它们可能会对包含许多突变位点的基因不起作用。

“例如，囊性纤维化跨膜传导调控基因大约有1800个不同的突变，”Gootenberg指出，“你不可能开发出1800种不同的治疗囊性纤维化的药物。所以与其采用这种方法，你完全可以用一个健康的基因将这个基因整个替换掉。你甚至不需要知道这个病人的基因有哪些突变。”

工具2：改善递送过程

Gootenberg、Abudayyeh以及Doudna都认为，实现CRISPR全部潜力的最大挑战是改进其体内递送过程。

Doudna认为我们会在未来十年看到这个过程，她说，“要使CRISPR成为可以解决目前所有已知疾病类型的标准治疗，我们需要精确地靶向更多细胞和组织类型”，这对于后续去开发负担得起和可使用的治疗方法至关重要。

对于需要针对全身施用CRISPR-Cas9系统的疾病，理想的递送方式是递送到特定细胞类型中，以此避免递送过程产生的脱靶效应。尽管病毒和纳米颗粒递送系统已经显示出了积极的前景，尤其是在递送到肝脏方面，但在其他细胞或组织方面还有很多工作要做，特别是在增强选择性方面。

利用非病毒载体实现特定细胞类型基因递送的所做的工作包含各种靶向分子（如小分子配体、肽和抗体）的表面修饰。其中一种方法是使用核酸适配体，这种单链寡核苷酸可以折叠成特定的结构并与其靶点（如蛋白质）结合。

Spotlight Therapeutics公司正在利用其靶向活性基因编辑（TAGE）的平台来开发工程化核糖核蛋白，以解决目前体内递送系统存在的多种局限性。这些核糖核蛋白是通过将跨膜运输分子（细胞穿膜肽）和细胞靶向分子（配体或抗体）与CRISPR核酸酶结合产生的。

“我们采用了一种生物制剂的方法，其结构借鉴了抗体偶联体能够将有效载荷拉‘拽’到靶标细胞中的成功经验，”Spotlight公司的总裁兼首席执行官Mary Haak-Frendscho博士说，“我们正在使用抗体或抗体衍生的工具将Cas9或Cas12递送到已装载了‘向导’的靶标细胞中。”

这些生物制剂的半衰期很短，并且在基因编辑发生后不会在体内持续留存。这种方式降低了脱靶裂解事件的发生风险，最大限度地减少了抗药物免疫反应的发生可能性，并且在给药方面具有更强的灵活性。

工具3：调控表观基因组

表观基因组是自然界给基因表达设置的看门人，其通过一些非常巧妙和高度保守的机制来添加或删除分子标记物，从而确定每个细胞的身份和功能。例如，这些标记可以使我们的神经元在一生中都能很好地保持神经元的状态。

通过靶向调控表观基因组，可以在不切断或断裂DNA的情况下对基因表达进行调控，这避免了使用基因编辑可能带来的一些副作用。

表观遗传药物开发公司Chroma Medicine首席执行官、医学博士Catherine Stehman-Breen表示，通过基因编辑调控基因就像开车撞上灯柱停下来时一样。“喇叭响了，挡风玻璃坏了，车就停了下来，”Stehman-Breen解释说，“如果在这个过程中你使用了刹车——这个本就用来停车的工具，你的损失就会小得多。这就是我对表观遗传学的看法。”

Chroma Medicine公司正在筹备一个基于CRISPR的模块化、高灵活度的平台，用于开发能让基因沉默或激活的表观遗传药物。

该平台将DNA结合区域与表观遗传效应区域相耦联。DNA结合区域致力于特异性靶向要被沉默或激活的基因，而效应结构区域则负责产生特异性甲基化模式来控制染色质构象和调控基因的转录。

在一些简单的应用中，这系统可以以单个基因作为靶点；在更复杂的应用中，其可能同时针对多个基因，一些基因被沉默，而另一些被激活。

Stehman-Breen表示Chroma平台提供的多靶点技术可以有很多应用。例如，这些工具可用于细胞疗法，因为利用基因编辑进行多靶点操作的效果可能并不理想，会遇到一些非常困难的挑战（如转座）。

“有了表观遗传调控，”Stehman-Breen说，“你可以操纵足够多的基因，而不会导致DNA的任何切割或混合。”

工具4：调控微生物

CRISPR领域另一个不断发展的方向与与微生物有关。CRISPR被包装成噬菌体去影响靶标细菌，这与CRISPR系统在自然界的存在方式恰好相反——细菌可以利用CRISPR来对抗噬菌体。

无疑，CRISPR技术有可能会对微生物群产生前所未有的影响。例如，它可以消除耐药菌而不伤害有益菌。这种调控过程对解决抗生素耐药性至关重要，因为抗生素的耐药性正在世界各地迅速蔓延，这严重阻碍了控制微生物感染的工作。

杀死特定的细菌只是控制微生物群的一种方式。另一种方法是对细菌进行基因改造，使其能够表达具有治疗作用的蛋白和肽。第二种控制形式展现了利用细菌来调控一些关键过程的前景，如代谢和免疫过程。

一个丹麦的公司Snipr Biome正在探索两种微生物组控制方法，该公司开发了一种名为CRISPR-Guided Vectors的专有技术。

Snipr Biome的联合创始人兼首席执行官Christian Grøndahl博士说：“我们可以通过插入表达蛋白质、抗体、酶或激素的基因来调控微生物组以达到治疗效果。”他补充说，该公司的技术可以用于调控微生物组，从而治疗2型糖尿病、肥胖、非酒精性脂肪性肝病和肠易激综合症等疾病。

在进行慢性治疗和活体治疗时，安全性是个大问题。“如果你引入了一个基因，”Grøndahl指出，“你必须能够控制它，在达到治疗效果或想降低它的表达时，关闭它的表达。”

为了做到这一点， Snipr Biome公司正在利用其技术来安装“安全开关”进而允许插入的基因被切除——这是我们控制微生物组的一个更好的方式。

“如果你想插入基因并调控微生物组，但又不想扰乱微生物组原本的多样性，”Grøndahl说，“那么仅仅用抗生素来杀死微生物组并不是一个好主意。

CRISPR未来的四个方向

CRISPR技术自问世以来，已经发生了很多轮的迭代与更新。比如其针对的对象可从DNA延申至RNA；其编辑方式从依赖DNA双链断裂后的修复机制，到不引起DNA链断裂的单碱基编辑；其应用也从简单的基因编辑，扩展到了疾病检测等领域。

日前，CRISPR技术先驱之一Doudna教授在一场会议上分享了她对CRISPR技术的未来展望，指出有四大场景值得期待。首先，CRISPR将带来治疗许多疾病的疗法。“我不想说所有疾病，但可以确定的是，这个技术能为许多疾病带来影响，不仅仅是罕见疾病。”她说道。之所以这么说，是因为围绕CRISPR，已经有了许多创新。

创新之一在于科学家们已经发现了越来越多类型的Cas蛋白，比如最初研究人员们主要关注Cas9，而现在多种Cas酶正不断涌现，包括靶向RNA，可以用于疾病诊断的Cas13；能大段删除DNA，堪称DNA碎纸机的Cas3；以及体积更小，更有希望在临床上完成递送的CasX。创新之二在于大量科学家正通过生物工程技术，不断优化这些蛋白、乃至整个CRISPR 系统的功能——通过碱基编辑，我们如今能对单个核苷酸进行精准的修改；通过“激活”或是“沉默”基因，我们无需改变基因组，就能短暂调控基因的表达；而当CRISPR技术结合表观遗传学，更是可以在指定的基因启动子片段进行甲基化或是去甲基化的修饰，长久地关闭或是开启基因的表达。如今，已有不少生物技术公司正在开发这些技术，推进其走进临床。当然，要发挥这些技术的潜力，还有不少问题需要解决，譬如如何将CRISPR基因编辑工具精准地递送到想要的细胞中去。

CRISPR的第二个未来场景在于带来“现货型”的细胞和基因疗法。Doudna教授指出，细胞和基因疗法带来了高度个体化的治疗方案，而生物医药领域期待此类疗法能变得更为大众化——“如果不能应用于所有不同的人，那至少也在广泛的不同的人里有着应用。”而要实现这一目的，则必须对基因改造细胞的生产流程进行标准化。这个过程中，CRISPR基因组编辑技术无疑将成为重要的工具。

第三个未来场景是使用CRISPR技术进行诊断与新药发现，这体现的是CRISPR技术的多样性。Doudna教授提到，目前FDA已经为一些基于CRISPR的诊断技术授予了紧急使用授权。而作为一种可编程的技术，只要经过简单的调整，它就有望应用于检测来自各种病原体的各种DNA或是RNA分子。

而在新药发现方面，CRISPR的简便性使其能用于大规模的自动化筛选，找到在健康生理过程，或是致病生理过程中的关键基因，促进研究人员们找到新的靶点。这一技术还能与人工智能进行很好的结合，让机器去分析CRISPR筛选所产生的大量数据集。“我认为CRISPR与人工智能的结合已经蓄势待发，将要变革新药发现。” Doudna教授展望道。

最后一个场景，则是让CRISPR技术成为疾病预防的工具，让疾病在发生前就消弭于无形。比如我们已经知道在阿尔茨海默病或是心血管疾病中，一些基因的存在会让个体发病的风险更高，另一些基因则会降低疾病的风险。如果CRISPR能用于改造这些基因，让我们人人都自带“基因保护伞”呢？这样的未来令人振奋。

尾声： CRISPR的下一个十年

在未来10年，我们可能会看到越来越多基于CRISPR的诊断方法和获批的药物。我们甚至可能看到目前认为永远无法治愈的遗传疾病在未来得到安全有效的治疗。CRISPR技术可能真的会取得重大进展，让人们能防患于未然。

依照这些思路，Doudna表示在未来十年，CRISPR的应用不是用于治疗，而是用于预防。

“CRISPR在治疗某些特定疾病方面的潜力已经得到了很多关注，但我也认为，在未来几年我们将会看到CRISPR在预防疾病有着全新的应用，”Doudna认为，“我们虽然已经看到CRISPR被用作一种诊断方法，并看到了快速、精准的诊断对防止疾病传播的重要性。但我们也可以去编辑使人们易患疾病的基因，包括衰老性疾病。”

尽管医疗保健领域的前景令人兴奋，但我们很容易忽视CRISPR可以为地球的未来带来的其他潜在好处。虽然关于CRISPR的临床应用有很多令人振奋的地方，但Doudna认为，CRISPR在农业和气候方面的应用有可能在全球范围内产生更重大的影响。

“我们现在开始看到CRISPR编辑的农产品，”Doudna指出：“未来几年，我们将看到更多解决粮食安全、增强抗旱和抗洪能力、减少农药和化肥使用、消除农业排放以及碳去除和封存等问题的技术。”

虽然未来具有不确定性，但有一件事我们都可以确定，那就是CRISPR很可能会在改变个人和地球的未来上发挥重要作用。